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분자진단 원천기술

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지놈프로젝트의 수행에 따른 대량 유전자 정보 시대 시대가 도래함에 따라 생물체의 유전자 정보는 유전자 진단 시장을 비롯하여 신약개발 사업에까지 고부가가치의 정보를 제공함으로써, 이를 활용한 생명공학사업의 경제 가치가 급속도로 성장하고 있는 추세입니다. 특히, 유전자 분석 기술은 유용한 유전자 정보(marker) 발굴을 위한 genomics, transcriptomics, pharmacogenomics, nutrigenomics 분야의 다양한 연구용 시장 (research market) 뿐만 아니라 임상 유전자 검사 분야 (clinical genotyping market)에 활용되고 있으며, 생물정보학 (bioinformatic)과 연계됨으로써 신약 개발 연구에까지 필수 기술로서 자리 매김되고 있습니다.
RFMP 기술은 유전자의 질량 차이를 이용한 DNA 변이 분석 원천 기술로서 (주)진매트릭스의 proprietary technology 입니다. 기존의 거의 모든 유전자 분석기술이 혼성화 (hybridization) 단계를 거쳐 유전자 변이를 분석함에 비해, RFMP 기술은 혼성화 단계 없이 유전자 변이를 직접 분석하는 비표지 NA (nucleic acid) 분석 기술입니다. DNA에 탐색자를 붙이는 기존의 DNA칩 기술과는 달리, DNA 내 유전 변이가 밀집한 주요 부위를 직접 절단해 내고, 조각난 유전자 절편의 질량을 측정함으로써 유전자형을 파악하는 신개념의 나노 진단법으로서 고도의 정확도와 시간당 400여 개 이상의 대용량 자동화 분석능력을 가지고 있습니다. RFMP-Genotyping Chemistries 와 RFMP - Chip 및 소재, MALDI-TOF 분석 기술, 고유의 Data Calling Algorithm 및 소프트웨어 (BaseCamp) 등, 복수의 요소 기술 들이 유기적으로 복합된 융합 기술 (Fusion technology) 입니다.

RFMP System은 특수하게 제작된 Proprietary Primer System 을 선택하여 사용하므로, 유전자 어느 부위에라도 적용이 가능하며, GC rich region으로 인해 기존의 sequencing 관련 기술로 분석이 어려운 경우도 매우 유용합니다. 또한 염기변이 중, 치환 (substitution)뿐만 아니라 염기의 결실(deletion), 삽입 (insertion)도 파악할 수 있고, 복수의 염기 변이가 산재하는 motif나 region도 분석 가능합니다. RFMP System은 대량의 샘플을 용이하게 분석할 수 있는 자동화 로봇 시스템으로 구축되었으며, 매뉴얼 구동도 가능하므로 소량의 샘플도 분석 가능합니다. 특수하게 제작된 프라이머 시스템 (NC™ Primer System)을 사용하여 PCR증폭, 제한효소 절단으로 생성된 피크(Peaks) 의 실제 질량값이 염기서열로부터 계산된 예상 질량값과 일치하여야 하므로 더욱 정확한 결과를 얻을 수 있습니다.


What is Restriction Fragment Mass Polymorphism(RFMP)?


RFMP Genotyping Technology는 절편화된 DNA의 분자량을 MALDI-TOF Mass pectrophotometry를 통해 분석함으로써, DNA의 염기서열을 분석하는 기술로서 Genomics 및 임상용 유전자형 분석에 광범위하게 적용 가능한 ㈜진매트릭스의 'Proprietary Technology' 입니다. 특정 제한효소 (Type IIS : 인지부위와 절단부위가 다른 제한효소)의 인지 부위 (RE core)를 포함하며 변이 염기나 부위의 upstream에 결합하는 특수 primer를 이용하여 PCR반응을 하고, 해당 제한효소로 절단하게 되면, 변이 부위를 포함하는 복수의 oligomers가 형성됩니다. 이 oligomers (Allele-Diagnostic Fragments)는 돌연변이의 종류에 따라 특정 질량을 가지게 되는데, 이 두 분자의 질량을 말디토프 질량분석기 (MALDI-TOF mass spectrometry)에서 측정함으로서 해당 유전자형을 파악하게 됩니다.
RE core에 사용하는 제한효소 서열은 genotyping하고자 하는 변이 부위나 인접부위를 고려해 다양한 조합으로 만들 수 있으므로 주위의 유전자 서열에 상관없이 다양한 부위를 분석할 수 있는 'Flexible Platform Technology'입니다.


Principle of MALDI-TOF Mass Spectrometry


질량분석법이 처음으로 사용되기 시작한 이래 다양한 이온화법이 발달되어 왔으며 일반적으로 EI(Electron Impact)가 표준 이온화 방법으로 널리 사용되고 있습니다.그러나 이 방법은 휘발성 시료에만 사용할 수 있으며, 열에 불안정한 시료에는 사용할 수 없는 단점을 가지고 있어 응용은 주로 유기 저분자에 한정되어 있습니다. 이러한 이유로 휘발성이 없거나 열 안정성이 없는 물질의 질량 분석을 위한 여러 가지 이온화 방법들이 개발되었는데 이렇게 개발된 방법들이 SIMS, FAB, MALDI등 입니다. 그 중에서도 MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)는 고분자 물질에 대해 시료의 분해 없이 기화/이온화가 가능한 방법으로 일반적으로질량이 크고 열에 불안정한 생체 고분자나 합성고분자에 매우 이상적으로 적용될 수 있는 방법으로 알려져 있습니다. 또한 TOF(Time of Flight) 분석기와 결합하여 고분자 연구에 있어 가장 각광 받고 있는 질량 분석법 입니다.
MALDI-TOF MS는 1980년대에 개발되었으며 기존의 질량 분석법과는 다르게 극단적인 조건 (예, 열분해)이 필요하지 않고 column을 사용하지 않아 다루기가 상대적으로 쉽습니다. 최근에는 생물학, 특히 단백질체학이나 생물정보학 분야에서 각광을 받고 있으며 생체물질들의 특이성, 예를 들면 항원-항체 반응이나 DNA-DNA hybridization, 생체적합성 실험을 위한 단백질 흡착 등을 분석하는 방법으로도 응용이 되고 있습니다. 이런 의미에서 MALDI-TOF는 생체 물질의 분석과 oligonucleotide sequencing 을 위한 방법으로 21세기의 생체 물질 분석 및 Genotyping의 주요한 기술로 응용될 것이 분명합니다.
MALDI-TOF의 원리는 레이저로 이온화가 잘 안 되는 단백질이나 핵산을 보조물질인 matrix (HPA: 3-hydroxypicolinic acid)와 섞어 이온화를 촉진함으로써 진공관에서 잘 날라가도록 (flight)한 원리에 기초합니다. 이온화 후 진공관에서 날아가는 속도는 mass에 반비례하므로 무거운 핵산은 늦게 detector에 탐지, 그래프 상의 m/z축의 오른 쪽에 위치하게 됩니다. 전기영동처럼 standard에 해당하는 oligomer를 reference로 넣어 주어 기계가 자동으로 unknown molecule의 질량을 display함으로써 single nucleotide polymorphism, insertion, deletion, multiplemutation을 지닌 motif를 detection할 수 있습니다.


General Advantages of RFMP Genotyping Technology


• High Accuracy & High Specificity

종래의 단일염기분석은 주로 primer 로부터 한 개의 염기가 extension하는 Single Base Extension(SBE) 법을 사용하고 있는데, 이 경우 primer가 분석하고자 하는 타겟 부위와 유사한 sequence와 반응될 수 있으므로 분석이 원하는 target 유전자 부위에서 정확하게 수행되는지의 여부를 검증하기 어렵습니다. 이에 비해 RFMP 분석법은 analyte 내에 primer에서 유래되지 않고 표적 유전자 부위에서 유래된 염기서열이 있으므로 oligomer의 질량이 예측치에서 벗어날 경우, PCR반응의 특이성 문제를 자체적으로 confirm할 수 있습니다 즉 assay가 원하는 target유전자부위에서 정확하게 수행되고 있는지를 자체적으로 검증할 수 있는 것입니다.

• Direct Analysis ; No Additional Primer Extension, Probe Hybridization nor Labelling

변이가 포함된 amplicon을 만든 후에 추가적인 primer extension이나 hybridization 과정 없이 바로 amplicon 자체를 제한효소로 자른 후에 질량을 분석하므로 매우 정확합니다. 즉 PCR 이후 추가적인 primer extension이나 probe hybridization과정을 수행하지 않으므로 실험 과정상 수반될 error 확률이 그만큼 줄게 되는 것입니다.

• Analysis of Both DNA Strands

Amplicon의 Both Strands를 분석하므로 Single Strand만을 대상으로 분석하는 경우(예: SBE , Sequencing) 보다도 높은 정확성을 지닌 분석법입니다.

• High Sensitivity & High Throughput

고감고 PCR과 말디토프 이온화 과정에 의해 분석 예민도가 현저히 개선되고, 대용량처리능력을 갖고 있어 대규모의 임상검사 수준에 부합하는 기술입니다.

• Simple Steps & Rapid Readouts

PCR, 제한효소 절단, 말디토프 분석의 3 단계의 단순한 검사 단계이기 때문에 보통 6~10단계 이상의 기존 방법에 비하여 편리하고 빠르게 결과를 얻을 수 있습니다.

• Flexibility & Haplotyping

RFMP Genotyping System은 GC rich region를 원하는 유전자 어느 부위에라도 적용이 가능합니다. GC rich region으로 인해 기존의 방법으로 분석이 어려운 경우도 매우 유용합니다. 또한 염기변이 중, 치환 (substitution)뿐만 아니라 염기의 결실 (deletion), 삽입 (insertion)도 파악할 수 있고, 복수의 염기 변이가 산재하는 motif나 region도 분석 가능합니다. 특히, methylation이나 acetylation과 같은 Epigenetics 연구에도 매우 유용한 분석법이며, 염기서열법이 불가능한 molecular haplotyping이 가능하므로 복수변이들의 일배체형 판독이 가능해져 임상 진단에 매우 효과적입니다.


RFMP for Clinical Genotyping


유전자의 돌연변이나 SNP검사에 개발된 기술 등은 대개 한 개 혹은 몇 개 이하의 염기 변이를 탐색하도록 개발된 기술이기 때문에 바이러스의 유전형과 같이 두 개 이상의 도메인에 여러 개의 변이가 다발하여 클러스터를 이루는 경우에는 적용에 한계가 있는 것이 현실입니다. 따라서 바이러스의 유전형 검사는 대개 주요 변이 몇 개만을 확인하거나 연구 수준에서 sequencing을 하는 방법이 대세였습니다.
DNA sequencing의 경우 많은 유전자 분석의 gold standard로 인정 받고 있음에도 불구하고, 일정 범위 내에 다수의 그리고 다양한 변이를 지닌 바이러스가 mixture infection 상태로 존재하는 경우 (실제로 많은 바이러스 infection은 mixture infection 상태로 존재함) major genotype의 진단만이 가능하고, 혼합 감염이나 변이의 haplotype은 판독하기 어렵습니다. 이러한 이유로 DNA sequencing은 임상 유전자 진단에는 분명 한계가 있는 것이 사실입니다. 이에 비해 당사의 RFMP™ Genotyping System은 기술상 일정 범위 내외에 클러스터를 이루는 변이의 클러스터를 용이하게 읽을 수 있고 혼합 감염시의 바이러스 간의 상대적 양과 변이간의 linkage를 보여주기 때문에 임상 유전형 검사에 최적의 진단 플랫폼이라고 할 수 있습니다.